Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

На малюнку 2 показані репрезентативні результати, отримані від стандартів і п'яти різних зразків. Як показано на цьому малюнку, збільшується фотоелектронний помножувач напруги відразу після того, як нітрити, що містять розчин (стандарти або проби) вводять в скороченні розчин (ін'єкції раз позначені червоними стрілками нижче кривої) і повертається до базового значення, як тільки все нітрит, присутніх в впорскується рішення було зменшено. Також ясно, з цього малюнка видно, що точні вимірювання об'єму необхідні для отримання високої відтворюваності даних. Ми рекомендуємо використовувати прецизійні Hamilton шприци для вимірювання об'єму уприскування. Втрата здатності зменшення в I 3 (або аскорбінова кислота або Vcl 3) розчину є ще одним поширеним джерелом помилок. Як правило, коли базова ширина піків починає значно збільшуватися, відновний розчин в реакційній камері повинна бути змінена. Ширина піку залежить від потоку газу в NOРеакціонная камера (позначено як RC на малюнку 1), і вона злегка змінюється від одного експериментальної установки до іншого. Ми вважаємо, що нормальна ширина складе близько 1 хв для вимірювання нітритів і до 2 хв для вимірювання нітратів.

Для того щоб зв'язати сигнал з ФЕУ з кількістю виявленого NO, стандартна крива будується як графік залежності площі під піком, і кількість нітриту (в пмоль) впорскується, як показано на фігурі 3А. Для вимірювання площі під піком будь-який зручний програмне забезпечення може бути використано, наприклад, походження, Excel або подобається. Нахил цієї кривої, K (відмічені червоним кольором на малюнку 3б), дає кількість пмоль NO викликає збільшення 1 мВ ФЕУ сигналу (ПМ). Перевага використання крутизну кривої, а не площа під піком, який пов'язаний з фіксованою кількістю NO, підвищується точність. Калібрувальна крива будується по крайней мере, 3 разлічнихточкі, причому кожен з них вимірюється в двох примірниках, і якщо є певний залишковий нітрит або нітрат в воді, що використовується для приготування стандартного розчину, використовуючи K виключає необхідність поправок до цих залишкових кількостей. Крім того, після наших первинних випробувань NOA інструменту для його ПМ лінійності, ми визначили, що лінійний відгук відбувається до 700 - 800 мВ. Таким чином, наша стандартна крива дійсна для всіх сигналів від зразків до цього діапазону ТЧ. Діапазон лінійності залежить від PM і може змінюватися з часом. Вона повинна бути визначена до того, як прилад вперше використаний і випробувані, як PM віку кожні кілька років.

Дані, зібрані зі зразків обробляються аналогічним чином, як і дані, зібрані для стандартної кривої: По-перше, площа під піком визначається. Потім ця область ділиться на схилі До стандартної кривої, яка дає число пмоль NO відбувається від кількості введеного зразка.

фігурі 3В. Потім дані нанесені аналогічно прикладу на малюнку 3B. У прикладі, наведеному на малюнку 3B побудована залежність результатів від 5 окремих зразків, показаних на панелі A. Тут ми наносимо середні значення від 2-х ін'єкцій і дають SD, щоб показати відтворюваності окремих точкових вимірювань.

Для отримання зразків на малюнку 3, S1, S2 і S4 крові щурів і S3 і S5 печінки щура. 3С показані кінцеві результати сюжет разом з СД і висловлювали в нмоль (для крові, п = 3) або PMол / мг тканини (для печінки, п = 2).

Малюнок 1: Налаштування Сіверса NOA Хемілюмінесцентний інструменту. Реакційний посудину заповнюють I 3 (аскорбінова / оцтова кислота або Vcl 3) розчину з газом - носієм Він обережно барботирования через. Зразок вводиться за допомогою шприца Hamilton через перегородку в I 3 розчину, де NO пов'язані компоненти не зводяться до NO газу і здійснюється в NO аналізатора. Холодна пастка, NaOH заповнені пастку, і фільтр захисту аналізатора від парів вологи і кислот. У реакційній камері (RC) NO газ в поєднанні з O 3 (генерується в генераторі O 3) з кисню O 2 з бака. Хемілюмінесценція сигнал від NO 2 * детектується фотоелектронний помножувач (ФЕП) і далі посилюється і обробляється. збір та аналіз даних виконуються на ПК. Вакуумний насоссоздается низький тиск в реакційній камері (RC) і евакуює отруйна NO 2 газу після вимірювання хемілюмінесценції через вугільний фільтр (CF). Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 2: Представник Участок замикаючих піків, породжених CL. Цей графік показує сигнал ФЕУ (ФЕУ) як функцію часу. Піки в результаті ін'єкції різних кількостей розчину 1 мкМ нітриту (стандартів) і 100 мкл зразків (S1 - S5) впорскується в дублікатах і трьох повторах (50 мкл стандартного розчину нітриту). Червоні стрілки під кривою вказують час ін'єкцій. Будь ласка , натисніть тут для перегляду а - ля rger версія цієї фігури.

Малюнок 3: Стандартна крива (A) і Представник Результати з щурячої крові і печінки (B), остаточні результати Plot (C). Стандартна крива (панель А) отримують шляхом введення 50, 100 і 150 мкл 1 мкМ розчину нітриту в воді, вимірювання площі під піками. Схил, K (червоний номер) дає нмоль NO, необхідне для збільшення 1 мВ в ФЕУ напруги. Оригінальні піки, які використовуються для стандартної кривої знаходяться на малюнку 2, і позначені як 50, 100 і 150 мкл. На малюнку 2 також показані вихідні ін'єкції для наших зразків - S1, S2 і S4 (темно - сірий) з крові щурів, S3 і S5 з тканини печінки щурів, все інжектованих в дублікаті. була виміряна площа під цими піками і, після того, як були зроблені всі виправлення для розведення, як описано в частині 3.2.1., РезULTS показані на панелі В окремих зразках були розраховані як кількість нітриту в пмоль / г печінки або в нМ крові. Щоб оцінити відтворюваності методу хемілюмінесценції, ми побудували середні значення і стандартні відхилення для кожного окремого зразка. Панель C показує кінцеві продукти нітритів і нітратів в крові і печінки щурів на графіку як середнє з трьох окремих зразків крові і два для печінки разом зі стандартним відхиленням. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.